دراسات تصنيفية على بعض انواع حشرات المن باستخدام التقنيات الحديثة

 

رسالة علمية

مقدمة الى الدراسات العليا بكلية الزراعة- جامعة الاسكندرية

استيفاء للدراسات المقررة للحصول على درجة

 

 

دكتوراه فلسفة فى العلوم الزراعية

 

 

فى

الحشرات الاقتصادية

 

 

مقدمة من

رضا محمد منصور طبيخة

 

 

 

 

 

 

 

 

2008

 

دراسات تصنيفية على بعض انواع حشرات المن باستخدام التقنيات الحديثة

 

مقدمة من

رضا محمد منصور طبيخة

 

للحصول على درجة

دكتوراه فلسفة فى العلوم الزراعية

 

 

فى

الحشرات الاقتصادية

 

 

لجنة المناقشة والحكم على الرسالة 

الأستاذ الدكتور : على زين العابدين عبد السلام 

أستاذ الوراثة المتفرغ  –  بكلية الزراعة – جامعة عين شمس

عميد كلية التكنولوجيا الحيوية – جامعة مصرللعلوم والتكنولوجيا

الأستاذ الدكتور : محمد سيد سلامة  

أستاذ علم الحشرات

عميد كلية العلوم – جامعة عين شمس

الأستاذ الدكتور : عبد الرحمن حسين أمين 

أستاذ الحشرات الاقتصادية المتفرغ

بكلية الزراعة – جامعة عين شمس

الأستاذ الدكتور : خليل عبد الله دراز   

أستاذ الحشرات الاقتصادية

عميد كلية الزراعة بدمنهور – جامعة الإسكندرية

 

التاريخ: 27 /8 / 2008

 

لجنة الاشراف:

 

الأستاذ الدكتور : عبد الرحمن حسين أمين

أستاذ الحشرات الاقتصادية المتفرغ

بكلية الزراعة – جامعة عين شمس

 

الأستاذ الدكتور : خليل عبد الله دراز

أستاذ الحشرات الاقتصادية

عميد كلية الزراعة بدمنهور – جامعة الإسكندرية

 

الأستاذ الدكتور : خالد عبد العزيز سليمان

أستاذ الوراثة

بكلية الزراعة – جامعة عين شمس

الملخص العربى

 

تعتمد عملية تميز الانواع المختلفة من المن فى مصر بدرجة كبيرة على الصفات المورفولوجية للحشرات الكاملة المجنحة, وان كانت لم تفى تلك الصفات المورفولوجية بمفردها فى عملية تميز بعض الانواع وخاصه بين الانواع شديدة القرابة مع بعضها البعض. مما دفع ذلك البعض من الباحثين الى استخدام الطرق البيوكيماوية و الجزيئية لتميز انواع المن والحشرات الاخرى بمصر. وكانت باكورة هذه الابحاث هو التمييز ما بين عشرة انواع من المن تابعة للجنس Aphisفى مصر. وبالتالى اهتم البحث الذى نحن بصدده الى استكمال تطبيقات الوسائل البيوكيماوية والجزيئية وعمل البصمة الوراثية لمجموعة اخرى من انواع المن الشائعة بمصر.

 

وبالتالى اهتم البحث الحالي بدراسة النقاط التالية:-

 

1)      عمل حصر لبعض انواع المن التابعة لقبيلة Macrosiphiniوتحت قبيلة Rhapalosiphinaبمصر.

2)   تميز وعمل بصمة وراثية لثمانية عشر نوعا من المن تابعة لهاتين المرتبتين وذلك باستخدام الفصل الكهربى للمشابهات الانزيمية و للبروتينات الكلية وايضا تطبيق تقنية تفاعل البلمرة المتكرر للحامض النووى DNARAPD-PCR )).

3)      تقيم كفاءة كل من الوسائل البيوكيماوية والجزيئية المستخدمة فى عملية تميز انواع المن.

4)      حصر الكاشفات البيوكيماوية والجزيئية الخاصة بانواع المن التى تحت الدراسة, وعمل مفتاح جزيئى للتميز بين ثلاثة عشر نوعا من المن.

5)      دراسة الاصل الشعبى  ودرجة القرابة ما بين انواع المن التى استخدمت فى الدراسة.

 

ويمكن ايجاز اهم النتائج فيما يلى:-

 

اولا: حصر بعض انواع المن وتسجيل الانواع الجديدة المتواجدة بالبيئة المصرية:-

 

تم حصر ثمانية عشر نوع من انواع المن الشائعة والتابعة الى  Tribe: Macrosiphiniو Sub-tribe: Rhapalosiphinaوذلك على عوائلها فى المناطق المختلفة بمصر. وقد امتدت عملية الحصر لاكثر من عامين ابتداء من ديسمبر 2005 حتى يونيو 2007. وقد اظهرت نتائج عملية الحصر بان هناك اربعة عشر نوع من المن اكثر شيوعا تتبع Tribe: Macrosiphiniوكانت هذه الانواع كالتالى:   Acyrthosiphon pisumوBrevicoryne brassicaeوBrachcaudus helichrysiوBrachycaudus schwartziوCapitophorus elaeaginaوChomaphis inculataوDoctynotus sonchiو Myzus persicaeو Nasonovia (Hyperomyzus) lactucaeو Pentalonia nigronervosaو Pleotrichophorus chrysanthemiو Macrosiphum rosaeو Macrosiphum (Sitobion) avenaeو Metopolophium dirhodumوكذلك تم حصر اربع انواع من المن اكثر شيوعا ايضا ولكنها تتبع Tribe: Aphidini (Sub-tribe: Rhapalosiphina)وكانت هذه الانواع الاربع كالتالى:  Hyalopterus pruniو Schizaphis graminumوRhopalosiphum maidis و Rhopalosiphum padi.

و خلال الدراسة الحالية قد سجل لاول مرة بمصر النوع Brachcaudus (Appelia) shwartzi (Borner)على اشجار الخوخ والمشمش بكثافة عالية خلال شهر مايو بمديرية التحرير بمحافظة البحيرة. وقد تلى ذلك القيام بالاجراء التصنيفى لهذا النوع والذى اشتمل على اجراء وصف لفظى ووصف بالرسم للنوع الجديد من خلال استخدام الافراد المجنحة المتوالدة بكريا, وكذلك تم تاكيد عملية التميز من خلال متحف التاريخ الطبيعى بالمللكة المتحدة. وقد اهتم البحث بعمل مفتاح تصنيفى للانواع التابعة للجنس Brachcaudusفى مصر مضافا اليه النوع الجديد الذى تم تسجيله بمصرلاول مرة.

 

ثانيا : الدراسات البيوكيماوية:-

 

1)    التفريد الكهربى للمشابهات الانزيمية:-

تم دراسة نواتج التفريد الكهربى الراسى لاربع نظم انزيمية هى   α-esteraseو  β-esteraseو Acid phosphatase و Alkaline phosphataseوذلك فى الثمانية عشر نوعا من المن التى تم حصرها. وقد اظهر تحليل الفصل الكهربى للنظم الانزيمية درجة من التباين المظهرى ما بين الانواع المدروسة وصل الى 96.88 % حيث اظهرت هذه النظم الانزيمية اثنا وعشرون حزمة مختلفة, كان منها حزمة واحدة مشتركة  للمشابه الانزيمى β- esteraseفى جميع الانواع المدروسة وبالتالى اعطى هذه الانزيم اقل درجة من التباين المظهرى 87.5%  ما بين الانواع المدروسة مقارنتا بالنظم الانزيمية الاخرى التى اظهرت تباين مظهرى مرتفع وصل الى 100%.

 

2)     التفريد الكهربى للبروتينات الكلية:-

                       

تم اجراء تحليل الفصل الكهربى للبروتينات الكلية للانواع الثمانية عشر من المن التى تحت الدراسة . حيث اظهرت هذه الدراسة وجود اثنين وثلاثين حزمة بروتينية منفصلة ذات اوزان جزيئية تراوحت ما بين 14.366 الى 245.578 كيلو دالتون. والتى اشتملت على تواجد زوج من الحزم التى مثلة كحزم مشتركة للانواع المدروسة مما يشير ذلك الى ان هذا التحليل يعطى درجة منخفضة من التباين المظهرى تصل الى 93.75%  ما بين الانواع مقارنتا بتحليل التفريد الكهربى للانزيمات والتحليل الجزئى للحامض النووى DNA.  وقد امكن تميز النوع Capitophorus elaeaginaبوجود حزمة بروتنية مميزه له فقط ذات وزن جزئى  23.789 كيلو دالتون.

     

ثالثا : الدراسات الجزيئية:-

 

تحليل RAPD-PCRلانواع المن:-

تم عمل البصمة الوراثية للثمانية عشر نوع من المن التى تحت الدراسة من خلال تفاعل البلمرة المتكررRAPD-PCR    للحامض النووى DNAوذلك باستخدام عشرة بدائات عشوائية التتابع وذلك لتحديد اهم المعلمات الجزيئية لهذه الانواع بالاضافة الى دراسة درجة القرابة فيما بين هذه الانواع وبعضها البعض . وقد اعطى هذه التحليل 101 حزمة من شظايا DNAذات مدى واسع من الاوزان الجزيئية بعد التفاعل مع البدائات العشر ذات التتابع عشوائي. وقد اظهر البادى B10اقل درجة من التباين ما بين الانواع المدروسة 80% وذلك نتيجة وجود اربع حزم مشتركة ما بين الانواع المدروسة من خلال هذا البادى. وعلى جانب اخر اظهرت كل من البادئات الستة التالية C15و D2و I17و L12و L20و UBC75و Z1درجة عالية من التباين ما بين الانواع المدروسة حيث  وصلت الى 100% . حيث اعطى البادى D2اعلى عدد من الحزم (15 حزمة) بينما اعطى البادى L13اقل عدد من الحزم (5 حزم فقط). وقد لوحظ وجود ستة وعشرون من الحزم الجزيئية اعتبرت كمعلمات متخصصة لبعض الانواع المدروسة حيث كان الغالب منها مع البادى I17اما كل من البادى L12  و  L20اعطى معلم نوعى واحد فقط. وقد اظهرت هذه البدائات جميعا معا نسبة تباين ما بين الانواع المدروسة وصلت الى 95%.

 

رابعا:  تقيم كفاءة الوسائل البيوكيماوية والجزيئية فى عملية تميز انواع المن:-

 

اظهر كل من تحليل الفصل الكهربى للمشابهات الانزيمية وتحليل البلمرة المتكررة للحامض النووىDNA  (RAPD-PCR) كفاءة عالية فى تميز انواع المن مقارنتا بتحليل الفصل الكهربى للبروتينات الكلية. حيث اعطت كل من هذه الطرق التحليلية سواء البيوكيماوية او الجزيئية عدد من الحزم وصل الى 160 حزمة. كان منهم 7 حزم مشتركة ما بين الانواع و34 حزمة كانت من المعلمات المميزة للانواع. وقد اظهرت هذه التقنيات مجتمعة درجة من التباين ما بين الانواع وصلت الى 95.21%.

 

خامسا: حصر وتحديد الكاشفات البيوكيماوية والجزيئية لانواع المن تحت الدراسة:-

 

 اوضحت النتائج ان هناك عدد كبير من الكاشفات الجزيئية تم الحصول عليها من خلال استخدام البادئات العشرة العشوائية وذلك مقارنتا بالكاشفات البيوكيماوية الناتجة من دراسة تحليل المشابهات الانزيمية او البروتين الكلى. حيث وجد ان هناك 13 نوع من المن الذى تحت الدراسة يمكن تميزهم بسهولة من خلال هذه الكاشفات. وان كانت كل من الانواع التالية Acyrthosiphon pisum و Brachycaudus schwartzi و  Myzus persicaeو  Macrosiphum rosaeوMetopolophium dirhodum لم تظهر اى حزم من الكاشفات الجزيئية المميزة لها مع البادئات المستعملة. وعلى عكس ذلك قد حقق النوع Doctynotus sonchiاعلى عدد من الحزم الكاشفة للنوع من خلال تحليل RAPD-PCR. كما وجد ان البادى I17قد حقق اعلى عدد من الحزم الكاشفة لانواع حيث تمكن من تميز خمس انواع من المن بمفرده هم Brevicoryne brassicaeو Nasonovia (Hyperomyzus) lactucaeو Macrosiphum (Sitobion) avenaeو Hyalopterus pruniو Schizaphis graminumبالمقارنة بالبادئات L12و L20التى اعطت كل منها حزمة واحدة كاشفة للانواع Rhopalosiphum maidis و Hyalopterus pruniعلى الترتيب.

 

اما الكاشفات المميزة لانواع والناتجة من تحليل المشابهات الانزيمية اوضحت ان مشابهات كل من انزيمىesterase   β-وAcid phosphataseكانت اكثر فاعلية فى تميز الانواع مقارنتا بالانزيمات الاخرى, حيث تمكن كل منهم من اظهار كاشفات نوعية للانواع التالية Brevicoryne brassicaeو Brachycaudus schwartziو Capitophorus elaeaginaو Nasonovia (Hyperomyzus) lactucaeو Macrosiphum rosaeو Rhopalosiphum padiو Hyalopterus pruni.

 اما تحليل البروتينات الكلية لانواع المن المدروسة فقد تمكن من تميز نوع واحد فقط هو Capitophorus elaeaginaوذلك من خلال حزمة بروتنية واحدة مميزة للنوع بوزن جزئى 23.789 كيلو دالتون.

 

وقد اوضحت الدراسة ان كل من الطرق البيوكيماوية والجزيئية المستخدمة فى تميز انواع المن تمكنة مجتمعة من تميز 15 نوع من المن من اجمالى 18 نوع وذلك من خلال اعطاها حزم كاشفة مميزة لهذه الانواع.  وان كانت الانواع التالية Acyrthosiphon pisumو Myzus persicaeوMetopolophium dirhodumلم تظهر اى من المعلمات البيوكيماوية او الجزيئية التى يمكن تميزها من خلالها.

 

وقد اقترح من خلال هذا البحث, ان الخمسة عشر نوعا التى وجد لها كاشفات نوعية مميزة, يمكن ان تميز من خلال تطبيق برنامج تحليل بيوكيماوى وجزيئى يحتوى فقط على تحاليل المشابهات الانزيمية لانزيمى β- esteraseو Acid phosphataseبالاشتراك مع التحليل الجزيئى باستخدام RAPD-PCRمع البدائات التالية B10و I17,و L12و L13وUBC75و Z1فقط . حيث وجد ان هذه المحتويات تكون كافية جدا لاعطاء درجة كبيرة من تميز الخمسة عشر نوعا من خلال معلماتهم البيوكيماوية او الجزيئية المميزة لكل نوع مما يوفر الجهد والوقت والادوات.

 كما تم تصميم مفتاح متفرع يعتمد على ستة وعشرون من الكاشفات الجزيئية المميزة والناتجة من العشر بدائات العشوائية المختبرة خلال الدراسة بحيث يمكن من خلاله تميز ثلاثة عشر نوعا من المن من اجمالى الثمانية عشر نوعا من المن تحت الدراسة .

 

سادسا: دراسة درجة القرابة ما بين الانواع:-

 

تم دراسة درجة القرابة الوراثية والاصل الشعبى ما بين الثمانية عشر نوعا من المن وذلك اعتمادا على الصفات المورفولوجية والنتائج المتحصل عليها من التحاليل البيوكيماوية الممثلة فى تحليل المشابهات الانزيمية والبروتينات الكلية بالاضافة الى تحليل البلمرة المتكرر للحامض النووىDNA(RAPD-PCR) . ومن ناحية اخرى تم دراسة تاثير التحاليل البيوكيماوية والجزيئية مجتمعه فى دراسة الاصل الشعبى ودرجة القرابة الوراثية ما بين هذه الانواع وبعضها البعض.

وبتحليل شجرة القرابة مابين الانواع التى  تحت الدراسة اعتمادا على صفاتها المورفولوجية , اظهرت النتائج ان اعلى درجة من التماثل بين الانواع (93.8%) قد وجدت ما بين Brachcaudus helichrysiو B. schwartzi. وكذلك قد وجد ان اقل درجة من التماثل (42.9%) ما بين الانواع كانت بين  Acyrthosiphon pisumو Chomaphis inculata. وبالتالى قسمت هذه الانواع الى ثلاث مجاميع رئيسية بناء على درجة القرابة فيما بينها اعتمادا على صفاتها المورفولوجية, حيث كانت المجموعة الاولى الرئيسية منقسمت الى مجموعتين فرعيتين,  الاولى منهم ضمت Brachcaudus helichrysiو B. Schwartziو Chomaphis inculataاما المجموعة الفرعية الثانية ضمت Doctynotus sonchiو Macrosiphum rosaeوNasonovia (Hyperomyzus) lactucaeو Rhopalosiphum padiو Macrosiphum (Sitobion) avenaeو Myzus  persicae. اما المجموعة الرئيسة الثانية فانها تضم Rhopalosiphum maidisو Hyalopterus pruniو Brevicoryne brassicae. واخيرا المجموعة الرئيسية الثالثة قد انقسمت ايضا الى مجموعتين فرعيتين , الاولى منهم ضمت Capitophorus elaeaginaو Pleotrichophorus chrysanthemiو Pentalonia nigronervosa, اما المجموعة الفرعية الثانية ضمت Metopolophium dirhodumو Schizaphis graminumو Acyrthosiphon pisum.

واوضحت نتائج الاصل الشعبى  مابين الانواع التى تحت الدراسة اعتمادا على التاثير المشترك للتحاليل البيوكيماوية والجزيئية والمشتملة على تحليل المشابهات الانزيمية والبروتينات الكلية و تحليل RAPD-PCR, ان اعلى درجة من التماثل ما بين الانواع (89.9%)  حيث لوحظة ما بين النوعين Rhopalosiphum maidisو R. padi, اما اقل درجة تماثل ما بين الانواع (43.9%) كانت ما بين النوعين  Brachycaudus helichrysiو Pleotrichophorus chrysanthemi.

كما اشارت نتائج دراسة الاصل الشعبى مابين الانواع التى تحت الدراسة اعتمادا على التاثير المشترك للتحاليل البيوكيماوية والجزيئية ما بين الانواع, الى ان هذه التحاليل تمكنة وبكفاءة عالية فى فصل انواع المن التى تصيب النجيليات عن باقى الانواع, والاكثر من ذلك اظهرت مدى الاتساع ما بين Tribe: Macrosiphiniو Tribe:Aphidini (Sub-tribe: Rhapalosiphina). حيث هذه الدراسة اظهرت ان الثمانية عشر نوع من المن يمكن ان تقسم فى مجموعتين رئيسيتين . المجموعة الرئيسية الاولى انقسمت الى ثلاث مجاميع فرعية. اولى هذه المجاميع الفرعية ضمت انواع المن التى تصيب النجيليات مثل Rhopalosiphum maidis و R. padi و Schizaphis graminumو Hyalopterus pruniو Macrosiphum (Sitobion) avenaeو Metopolophium dirhodum. اما المجموعة الفرعية الثانية ضمت  Acyrthosiphon pisumو  Brevicoryne brassicaeو Capitophorus  elaeaginaو Doctynotus sonchiاما الجموعة الفرعية الثالثة ضمت Pleotrichophorus chrysanthemiو Macrosiphum rosaeو Chomaphis inculataو Myzus persicaeوNasonovia (Hyperomyzus) lactucaeو Pentalonia nigronervosa. اما المجموعة الرئيسية الثانية ضمت النوعين المتقاربين Brachycaudus helichrysi و B. schwartzi.

 

               
 
 
   
 
   
 
   

 

أخر تحديث للصفحة : 7/1/2015 1:00:44 PM
عدد القراءات : 382

جميع الحقوق محفوظة لجامعة دمنهور © 2016
تصميم وتنفيذ مشروع البوابة الإلكترونية