RELATIONSHIP BETWEEN THE GROWTH STAGE, OOCYTES QUALITY, CULTURE SYSTEM, CRYOPRESERVATION AND VITRIFICATION WITH THE GENE EXPRESSION OFIN VITRO PRODUCED BOVINE EMBRYOS

 

 

A Thesis

 

Submitted to the Graduate Faculty of Agriculture, Damanhour University

in Partial Fulfillment of the requirements for the degree of

 

 

 

 

Doctor of Philosophy

 

 

in

 

Animal Production

 

 

 

By  

 

Mohamed Mohsen Mohamed Mansour

 

 

 

 

2011

 

 

 

علاقه مرحلة النمو وجودة الخلايا البيضيه ونظام الزرعوالتجميد البطئ والسريع بالتعبير الجيني لأجنة الأبقار المنتجةمعملياّ

 

رسالة علمية

 

 

مقدمة إلى الدراسات العليا بكلية الزراعة -جامعة دمنهور

استيفاءً للدراسات المقررة للحصول على درجة

 

 

 

الدكتوراة

 

في

  الإنتاج الحيوانى

 

 

مقدمة من

 

محمد محسن محمدمنصور

 

 

 

 

2011

 

 

 

         

Advisors’ Committee:

 

Dr.Fekry Mohamed Hussein

Professor of Theriogenology, Dean Faculty of Veterinary Medicine, Alexandria University, Egypt

 

Dr. Abd El Razek El- Saied Tag El-Din

Professor of Animal nutrition, Department of Animal and poultry production,Faculty of Agriculture, Damanhour University, Egypt

 

Dr. Osamu Dochi

Professor of Applied Reproductive Technologies, Faculty of Dairy Science, Rakuno Gakuen University, Japan

 

Dr. Saad El-Din El-Mekkawy

Lecturer of Animal physiology, Department of Animal and poultry production, Faculty of Agriculture, Damanhour University, Egypt

 

 

 

 

لجنة الإشراف:

 

الأستاذ الدكتور / فكري محمد حسين

أستاذ فسيولوجيا التناسل , عميد كلية الطب البيطري

 جامعة الإسكندرية – جمهورية مصر العربية

 

الأستاذ الدكتور / عبد الرازق السعيد تاج الدين

أستاذ تغذية الحيوان ,  قسم الإنتاج الحيواني و الداجني

 كلية الزراعة – جامعة دمنهور– جمهورية مصر العربية

 

الأستاذ الدكتور / أوسامو دوتشي

أستاذ تطبيقات تكنولوجيا التناسل , كاية علوم الالبان

 جامعة راكونوا جاكن – اليابان

 

الدكتور/ سعد الدين المكاوي

مدرس فسيولوجيا الحيوان ، قسم الإنتاج الحيواني و الداجني

 

كلية الزراعة – جامعة دمنهور – جمهورية مصر العربية

-SUMMARY

The study intended for determining the relationship between the embryonic development and the gene expression of the bovine embryos obtained from IVP with the; zygote development stage, oocytes morphological quality, culture conditions system, cryopreservation and vitrification.

a-                   Experiment 1: Relationship between the zygote Development Stage and Gene Expression Levels of IVP Bovine Embryos.

In this experiment, the relationship between the different development stages (2 – 4 cell, > 4 cell, Morula and blastocyst) of bovine embryos with the embryonic development and the expression profiles of Oct-4, Nanog, connexin 43, and Glut-1 gene transcripts were investigated. The oocytes were allowed to mature in TCM-199, then, they were subjected toIVF and finally, 18 h after fertilization, the zygotes were cultured in CR1aa medium. Aliquots of Day 7 blastocysts (5 embryos per aliquot for each stage) were removed to analyze the gene expression profileby QPCR. The results exhibited the followings:

1-                           The RQ level of Oct-4 gene transcripts was higher significant (P < 0.05) in the development stage which was > 4 cell as compared to the other development stages (2 – 4 cell, Morula and blastocyst, respectively).

2-                           There were no significant differences due to development stage of 2 – 4 cell, Morula and blastocyst on Oct-4 levels.

3-                           Transcript RQ for Nanog gene transcripts were detected at significantly higher levels (P < 0.05) in 2 – 4 cells as compared to > 4 cell, Morula and blastocyst stages respectively.

4-                           Also RQ levels of Nanog gene transcripts were more significant at blastocyst stage as compared to Morula stage.

5-                           There were no significant differences on Nanog levels between the blastocyst stage and > 4 cell stage or between the > 4 cell stages and Morula stage.

6-                           The RQ levels of Connexin-43 gene transcripts were insignificant (P < 0.05) across the different development stages of bovine embryos obtained from IVP.

7-                           The RQ levels of GLUT-1 gene transcripts was significantly (P < 0.05) higher in the blastocyst as compared to the 2 – 4 cell or > 4 cell stages respectively.

8-                           There were no significant differences on GLUT-1 levels between the blastocyst and Morula stage or between the Morula stage from side and 2 – 4 cell stage and > 4 cell stage from the other side.

b-                  Experiment 2: Relationship between the Oocytes Morphological Quality with the Embryonic Development and the Gene Expression of the Bovine Embryos Produced In Vitro.

In this trial, the relationship between the bovine oocytes of different qualities (grades 1, 2, 3, and 4) with the embryonic development and the expression profiles of Oct-4, Nanog, connexin 43, and Glut-1 gene transcripts were demonstrated. The oocytes were allowed to mature for 20 h in the culture medium, at 38.5°C in an atmosphere comprising 5% CO2. Then, they were subjected to IVF and finally, the zygotes were cultured in CR1aa medium at 38.5°C in an atmosphere comprising 5% CO2, 5% O2, and 90% N2 for 9 days. Day 7 blastocysts (5 embryos per aliquot for each grade) were removed from the different oocytes group to measure the gene expression abundance levels.The consequences exhibited the followings:

1-                           The percentage of the cleavage ratio was higher significant (P < 0.05) in grade 1 and 2 oocytes as compared to grade 3 and 4 oocytes (75.0 %, 72.7 %, 36.9 % and 33.3 % for grade 1, 2, 3 and 4 oocytes respectively).    

2-                           Likewise, the percentage of blastocyst rate was higher significant in grade 1 and 2 oocytes as compared to grade 3 and 4 oocytes (38.7 %, 38.0 %, 14.7 %, 7.7 % for grade 1, 2, 3 and 4 oocytes respectively).

3-                           The total cell number (mean ± SEM) in blastocyst which obtained from the grade 1 oocytes was highest significant (P < 0.05) as compared to those obtained from grade 2 and 3 oocytes (211 ± 4.74, 156.9 ± 5.23 and 134 ± 4.23 for grade 1, 2 and 3 oocytes respectively).

4-                           Also, the total cell number of blastocyst obtained from grade 2 oocytes was more significant (156.9 ± 5.23) as compared to that obtained from grade 3 oocytes (134 ± 4.23).

5-                           The RQ level of Oct-4 gene transcripts was higher significant (P < 0.05) in the in the blastocyst which obtained from the grade (1) oocytes as compared to that which obtained from the oocytes of other grades.

6-                           Also, the RQ of Oct-4 in blastocyst which obtained from the grade 2 oocytes was more significant (P < 0.05) as compared to that which obtained from grade 4 oocytes.

7-                           There were no significant differences on Oct-4 levels between the blastocyst which obtained from the grade 2 and 3 oocytes or between the blastocyst which obtained from the grade 3 and 4 oocytes.

8-                           The RQ level of Nanog gene transcripts was higher significant (P < 0.05) in the blastocyst which obtained from the grade 1 and 2 oocytes as compared to those obtained from grade 3 and 4 oocytes.

9-                           There were no significant differences on Nanog levels between the blastocyst which obtained from the grade 1 and 2 oocytes or between the blastocyst which obtained from the grade 3 and 4 oocytes.

10-                       The RQ levels of connexin-43 across the different oocytes grades were insignificant (P < 0.05).

11-                       The RQ levels for GLUT-1 gene transcripts were significantly higher (P < 0.05) in the blastocyst which obtained from the grade 1 and 4 oocytes as compared to the blastocyst which obtained from the grade 2 and 3 oocytes.

12-                       Even so, the Glut-1 level in the blastocyst which obtained from the grade 4 oocytes was significantly lower (P < 0.05) as compared to that which obtained from the grade (1) oocytes.

13-                       There were no significant differences (P < 0.05) were found between the blastocyst which obtained from the grade 2 and 3 oocytes with respect to GLUT-1 expression levels.

c-                   Experiment 3: Effect of Culture Conditions System on the Embryonic Development and Gene Expression Profiles of IVP Bovine Embryos.

In this experiment, the effect of individual (1 oocyte per 3 or 5 μl of culture medium) and small or group culture conditions culture condition (3, 5, or 20 oocytes per 3 or 5 μl of culture medium) on embryonic development and on the expression profile of Oct-4, connexin 43, and Glut-1 gene transcripts were evaluated. The oocytes were allowed to mature for 20 h in TCM-199, subsequently, they were subjected to IVF and finally, the zygotes were and cultured in CR1aa medium according to a previously described culture condition system. Aliquots of Day 7 blastocysts (5 embryos per aliquot for each group) were removed to measure the abundance of gene expression levels. The results exhibited the followings:

1-                           There were no significant differences (P < 0.05)  were observed for the cleavage ratio between the different culture systems (73.5 %, 67.5 %, 72.7 %, 70.3 %, 69.4 %, 70.2 %, 66.7 % and 65.3 % for 1, 3, 5 or 20 oocytes per 3 or 5 μl of culture medium, respectively).   

2-                           Also, the percentage of blastocyst rate between the different culture systems were insignificant (38.8 %, 34.2 %, 43.3 %, 36.0 %, 33.7 %, 36.0 %, 33.3 % and 36.0 % for 1, 3, 5 or 20 oocytes per 3 or 5 μl of culture medium respectively).     

3-                           The total cell number (mean ± SEM) of blastomere per blastocyst were insignificant (103±10.5, 92.7±12.4, 99.9±9.1, 111.8±7.8, 95.7±8.8, 120±9.8, 98.1±12.4 and 104.6±7.6 for 1, 3, 5 or 20 oocytes per 3 or 5 μl of culture medium respectively).

4-                           There were no significant differences (P < 0.05) were shown between the different culture systems with respect to Oct-4 expression levels.

5-                           The average RQ levels of Nanog gene transcripts in different culture groups of IVP bovine embryos were insignificant (P < 0.05).             

6-                           The RQ levels of connexin-43 across the different culture systems were insignificant (P < 0.05).

7-                           The RQ of GLUT-1 gene expression profile in different culture groups of IVP bovine embryos was non significant (P < 0.05).

d-                  Experiment 4: Relationship between the Cryopreservation or the Vitrification with the Embryonic Development and Gene Expression Levels of IVP Bovine Embryos.

In this trial, the effectiveness’s of slow freezing method (Cryopreservation) and vitrification by using the ultra-rapid freezing (Cryotop) on embryonic development and gene expression profile of oct-4, nanog, connexin 43 and GLUT-1 gene transcripts were studied. The oocytes were allowed to mature in TCM-199, then, they were subjected to IVF and finally, the zygotes were cultured in CR1aa medium at for 9 days. An expanded blastocyst was equilibrated by subjecting them to either the slow or fast pre-equilibration method. A control group (without freezing) was also making as a comparison group with the other treatments. After thawing (in treatment group) pool of blastocysts (5 embryos per pool) were taken to measure the gene expression abundance levels. The results exhibited the followings:      

1-                           The percentage of the cleavage ratio was (74.0 %) and the embryonic development rate was (37.4 %).

2-                           The embryonic reexpansion was significantly higher (P < 0.05) in the vitrification treatment as compared to cryopreservation treatment (92.9 % and 36.4 % for the vitrification and cryopreservation treatments respectively).

3-                           There were no significant differences (P < 0.05) were shown between the different freezing treatments with respect to Oct-4 expression levels.

4-                           The differences of RQ levels for Nanog gene transcripts between the vitrification and cryopreservation groups were insignificant (P < 0.05).

5-                           The RQ levels of connexin-43 across the different freezing treatments were insignificant (P < 0.05).

6-                           The RQ of GLUT-1 gene expression profile in different freezing treatments of IVP bovine embryos was non significant (P < 0.05).

Collectively, this study has concluded that;

v  Bovine IVP generally expressed oct-4 and Nanog variably. This may be in part due to the variation among embryos in development.

v  Glucose is the critical energy source required during compaction and blastulation in IVP of bovine embryos.

v  In the bovine embryos obtained by IVP, the development was better with the oocytes of grade 1 and 2 than with the oocytes of grade 3 and 4. In addition, the RQ of Oct-4 and Nanog gene transcripts seem to be in agreement with the simple morphological evaluations of bovine embryos obtained from IVP.

v  Depending on the culture conditions, embryos produced individually and those produced in small or group culture conditions possess the same developmental competence.

v  The culture conditions and constituents of the medium are more important factors than the number of embryos per volume of the medium, influencing in vitro bovine embryonic development and gene expression levels.

 

v   The Cryotop vitrification is an efficient method for bovine IVP embryo cryopreservation as compared to the traditionally cryopreservation method. 

الملخص العربى

أجريت هذه الدراسة بمعمل التطبيقات التكنولوجية فى مجال التناسل و معمل الجينات بقسم علوم الألبان ، جامعة راكونوا جاكين ، اليابان بالتعاون مع قسم الإنتاج الحيوانى والداجنى ، كلية الزراعة جامعة دمنهور فى الفتره من أكتوبر 2009 الى أكتوبر 2010.

و الهدف منها هو دراسة العلاقة بين نمو الأجنة والتعبير الجينى لأجنة الأبقار المتحصل عليها من الإنتاج المعملى للأجنة مع كلاّ من مرحلة نمو الجنين و جودة الخلايا البيضية و نظام الإستزراع و التجميد البطئ والسريع للأجنة.

أ‌-                 التجربه الاولى – العلاقه بين مرحلة نمو الجنين ومستوى التعبير الجينى لأجنة الأبقار المنتجه معمليا.

أجريتهذه التجربة لدراسة العلاقة بين مراحل النمو المختلفه لأجنة الأبقار المنتجه معملياّ مع التعبير الجينى لجينات الـOct-4وNanogوConnexin-43و  GLUT-1. تم تجميع المبايض (الغالبيه العظمى من أبقار الهولشتين) من السلخانات الموجوده بمنطقة هويكايدو – اليابان حيث تم وضعها فى محلول فسيولوجى عند درجة حرارة 18-25م ثم تم نقلها بصوره سريعه الى المعمل. عند الوصول للمعمل تم غسل المابيض مرتين باستخدام المحلول الفسيولوجى الدافي ثم تم أستخلاص الخلايا البيضيه من الحويصلات ذات القطر 2-6ملميترحيث تم اجراء الفحص المورفولوجى للخلايا البيضيه وتقسيمها الى درجات الجوده المختلفه. بعد ذلك تم إنضاج الخلايا البيضيه فى الـ TCM-199 ثم اجريت عملية الإخصاب وبعد ذلك بـ 18ساعه تم زرع الأجنة فى الـ CR1aa. تم جمع البلاستوسيت فى اليوم السابع لتقدير التعبير الجينى باستخدام الـ  QPCR. وكانت أهم النتائج المتحصل عليها ما يلى :

1.    كان المستوى النسبى للتعبير الجينى للجين الناسخ Oct-4  أعلى معنوياّ فى مرحلة النمو (اكبرمن4 خلايا) مقارنة بباقى مراحل النمو.

2.     لم تكن هناك إختلافات معنوية فى مستوى تعبير ال Oct-4بين مراحل النمو 2-4 خلايا و الموريولا والبلاستوسيست.

3.    كان المستوى النسبى للتعبير الجينى للجين الناسخ Nanog أعلى معنويا فى مرحلة النمو 2 – 4 خلايا مقارنة بمراحل النمو (أكبرمن 4 خلايا والموريولا والبلاستوسيست على التوالى).

4.    أيضاّ كان مستوى تعبير الـــ  Nanogأكثر بصوره معنويه عند مرحلة البلاستوسيست مقارنة بمرحلة الموريولا.

5.    لم تكن هناك إختلافات معنوية فى مستوى تعبير الــ Nanogبين مرحلة البلاستوسيست ومرحلة النمو أكبرمن 4 خلايا أو بين مرحلة أكبرمن 4 خلايا و الموريولا.

6.     لم تكن هناك إختلافات معنوية فى المستوى النسبى للتعبير الجينى للجين الناسخ    Connexin-43 خلال مراحل النمو المختلفه لأجنة الأبقار المتحصل عليها بصوره معملية.

7.    كانالمستوى النسبى للتعبير الجينى للجين الناسخ GLUT-1 أعلى بصوره معنويه فى مرحلة البلاستوسيست مقارنة بمراحل النمو 2 – 4 خلايا أو أكبر من 4خلايا على التوالى .

8.     لم تكن هناك إختلافات معنوية فى مستوى تعبير الـــ GLUT-1بين مرحلة البلاستوسيست و الموريولا أوبين مرحلة الموريولا من جانب ومراحل النمو 2 – 4 خلايا أو أكبر من 4خلايا من جانب أخر.

ب‌-            التجرب الثانيه- العلاقه بين جودة الخلايا البيضيةمع نمو الأجنه ومستوى التعبير الجينى لأجنة الأبقار المنتجة معمليا.

فى هذه التجربة تم دراسة العلاقة بين جودة الخلايا البيضية لأجنة الأبقار المنتجه معمليا مع التطور الجينينى و التعبير الجينى لجينات الـOct-4وNanogوConnexin-43و  GLUT-1. الخلايا البيضية تم إنضاجها فى الـ   TCM-199  لمدة 20 ساعه عند درجة حراره 38,5 فى جو من الغازات اشتمل على 5 % ثاتى أكسيد الكربون . ثم أجريت عملية الإخصاب وفى النهايه تم زرع الأجنة فى الـ CR1aaلمدة 9 أيام عند درجة حراره 38,5 فى جو من الغازات اشتمل على5 % ثاتى أكسيد الكربون و 5 % أكسجين و 90 % نيتروجين  تم جمع البلاستوسيت فى اليوم السابع لتقدير التعبير الجينى باستخدام الـ  QPCR. وكانت أهم النتائج المتحصل عليها ما يلى :

1.    كانت النسبه المئويه للـ cleavage ratioأعلى معنوياّ فى الخلايا البيضيةذات الجوده 1و2 مقارنة بالخلايا ذات الجودة 3و4 (75,0 % و72,7 % و 36,9 % و 33,3 % على التوالى).

2.    كانت النسبه المئويه للــ  blastocyst rateأعلى معنوياّ فى الخلايا البيضية  ذات الجوده 1و2 مقارنة بالخلايا ذات الجودة 3و4 (38,7 % و 38,0 % و 14,7 % و 7,7 % على التوالى).

3.    كان العدد الكلى لخلايا البلاستوسيست المتحصل عليه من الخلايا ذات الجوده 1 أعلى بصوره معنويه مقارنة بالمتحصل عليه من الخلايا ذات الجوده 2و3 (211 ,156.9 , 134 على التوالى).

4.    كان العدد الكلى لخلايا البلاستوسيست المتحصل عليه من الخلايا ذات الجوده 2 أعلى بصوره معنويه مقارنة بالمتحصل عليه من الحويصلات ذات الجوده 3.

5.    كان المستوى النسبى للتعبير الجينى للجين الناسخ Oct-4  أعلى معنوياّ فى البلاستوسيست المتحصل عليه من الخلايا ذات الجوده 1 مقارنة بالمتخصل عليها من الخلايا الاخرى .

6.    كان مستوى تعبير الــ Oct-4أعلى معنوياّ فى البلاستوسيست المتحصل عليه من الخلايا ذات الجوده 2 مقارنة بالمتخصل عليها من الخلايا ذات الجوده 4.

7.      لم تكن هناك إختلافات معنوية فى مستوى تعبير الــ Oct-4بين البلاستوسيست المتحصل عليه من الخلايا ذات الجوده 2 و 3 اوبين البلاستوسيست المتحصل عليه من الخلايا ذات الجوده 3و4.

8.    كان المستوى النسبى للتعبير الجينى للجين الناسخ Nanogأعلى معنويا فى البلاستوسيست المتحصل عليه من الخلايا ذات الجوده 1و2 مقارنة بالمتحصل عليه من الخلايا ذات الجوده 3و4.

9.      لم تكن هناك إختلافات معنوية فى مستوى تعبير الــ Nanogبين البلاستوسيست المتحصل عليه من الخلايا ذات الجوده 1و2 او بين البلاستوسيست المتحصل عليه من الخلايا ذات الجوده 3و4.

10.       لم تكن هناك إختلافات فى المستوى النسبى للتعبير الجينى للجين الناسخ    Connexin-43بين الخلايا البيضية ذات الجودة المختلفه .

11.     كان المستوى النسبى للتعبير الجينى للجين الناسخ GLUT-1 أعلى بصوره معنويه فى البلاستوسيست المتحصل عليه من الخلايا ذات الجوده 1و4 مقارنة بالمتحصل عليه من الخلايا ذات الجوده 2و3.

12.     كان مستوى تعبير الــ GLUT-1 أقل بصوره معنويه فى البلاستوسيست المتحصل عليه من الخلايا ذات الجوده 4 مقارنة بالمتحصل عليه من الخلايا ذات الجوده 1.

13.     لم تكن هناك إختلافات معنوية فى مستوى تعبير الــ GLUT-1 بين البلاستوسيست المتحصل عليه من الخلايا ذات الجوده 2و3 .

ج- التجربة الثالثه- تأثير حالة نظام الاستزراع على التطور الجينينى ومستوى التعبير الجينى لأجنة الأبقار المنتجه معمليا.

 فى هذه التجربة تم دراسة تأثير نظام الإستزراع الفردى أو فى مجموعات على التطور الجينينى و التعبير الجينى لجينات الـOct-4وNanogوConnexin-43و  GLUT-1. الخلايا البيضية تم إنضاجها فى الـ   TCM-199واتبع ذلك بإجراء عملية الإخصاب ثم تم زرع الأجنه فى بيئة الزرع وفقاّ لنظم الإستزراع السابقة . تم جمع البلاستوسيت فى اليوم السابع لتقدير التعبير الجينى باستخدام الـ  QPCR. وكانت أهم النتائج المتحصل عليها ما يلى :

1.     لم تكن هناك إختلافات معنوية بالنسبه للــ  cleavage ratioبين نظم الاستزراع المختلفه (73,5% و 67,5% و72% و70,3 % و 69,4% و 70,2 % و 66,7 % و  65,3 % لنظام الإستزراع 1و3و5و20 حويصله مبيضيه لكل 3 او 5 ميكروليتر من بيئة الإستزراع على التوالى ).

2.    أيضا لم تكن هناك إختلافات معنوية بالنسبه لـ النسبه المئويه لــ blastocyst rate (38,8 % و 34,2 % و 43,3 % و 36,0 % و 33,7 % و36,0 % و 33,3 % و 36,0 % لنظام الإستزراع 1و3و5و20 حويصله مبيضيه لكل 3 او 5 ميكروليتر من بيئة الإستزراع على التوالى).

3.     لم تكن هناك إختلافات معنوية ببين نظم الإستزراع المختلفه فيما يحتص بالعدد الكلى لخلايا البلاستوسيست (103و 92,7 و 99,9 و 111,8 و 95,7 و 120 و 98,1 و 104,6 لنظام الإستزراع 1و3و5و20 حويصله مبيضيه لكل 3 او 5 ميكروليتر من بيئة الإستزراع على التوالى).

4.     لم تكن هناك إختلافات معنوية ببين نظم الإستزراع المختلفه فيما يختص بـمستوى التعبير النسبى للجين الناسخ Oct-4  .

5.     كان المستوى النسبى للتعبير الجينى للجين الناسخ Nanog عند نفس المستوى المعنوى بين نظم الإستزراع المختلفة.

6.     لم تكن هناك إختلافات معنوية فى المستوى النسبى للتعبير الجينى للجين الناسخ    Connexin-43بين نظم الإستزراع المختلفة.

7.    كان المستوى النسبى للتعبير الجينى للجين الناسخ  GLUT-1   بين نظم الإستزراع المختلفة عند نفس المستوى المعنوى.

د- التجربة الرابعه – العلاقه بين التجميد البطئ أو السريع للأجنة بالتطور الجينيني ومستوى التعبير الجينى لأجنة الأبقار المنتجه معمليا.

فى هذه التجربة تم دراسة تأثير التحميد البطئ أو السريع لاجنة الأبقار المنتجه معملياّ على التطور الجينينى و التعبير الجينى لجينات الـOct-4وNanogوConnexin-43و  GLUT-1. الخلايا البيضية تم إنضاجها فى الـ   TCM-199واتبع ذلك بأجراء عملية الإخصاب ثم تم زرع الأجنه فى بيئة الزرع . تم تجميد البلاستوسيست وفقا لنظم التجميد السابقه (البطئ أو السريع) وبعد الإساله تم أخذ عدد 5 أجنه لكل مجموعه وذلك لتقدير التعبير الجينى باستخدام الـ  QPCR. وكانت أهم النتائج المتحصل عليها ما يلى :

1.     كانت النسبه المئويه للـ cleavage ratio(74 %) ونسبة التطور الجينينى كانت (37,4 %).

2.     كانت النسبه المئويه للاسترداد الجينينى أعلى بصورة معنويه فى المعاملة بالتجميد السريع (92,9 %) مقارنة بالمعاملة بالتجميد البطئ (63,4 %).

3.     لم تكن هناك إختلافات معنوية بين معاملات التجميد المختلفه فيما يختص بالتعبير الجينى للجين الناسخ Oct-4  .

4.     كان المستوى النسبى للتعبير الجينى للجين الناسخ Nanog عند نفس المستوى المعنوى بين نظم التجميد المختلفة.

5.     لم تكن هناك إختلافات معنوية فى المستوى النسبى للتعبير الجينى للجين الناسخ    Connexin-43بين معاملات التجميد المختلفه.

6.     لم يكن المستوى النسبى للتعبير الجينى للجين الناسخ  GLUT-1   بين معاملات التجميد المختلفه معنوياّ.   

و تخلص هذه الدراسة إلى ما يلي:

                               I.      يكون المستوى النسبى للتعبير الجينى للجين الناسخ Oct-4و الــ Nanogفى أجنة الأبقار المنتجه معمليا متغيراّ وذلك ربما يرجع للأختلافات بين الأجنة فى النمو.

                             II.      يعتبرالجلوكوز المصدر الحيوى للطاقة خلال مرحلة البلاستوسيت لأجنة الأبقار المنتجه معملياّ.

                          III.      كان النمو فى أجنة الأبقار المتحصل عليها من الإنتاج المعملى أفضل فى الخلايا البيضيةذات الجوده 1و 2 مقارنة بالخلايا ذات الجودة 3و4 . بالاضافه لذلك فإن المستوى النسبى للتعبير الجينى للجين الناسخ Oct-4و الــ Nanogيبدو متوافقا مع التقييم المورفولوجى لأجنة الأبقار المنتجه معمليا.

                         IV.      يمكن للأجنه المنتجه بنظم إستزراع فرديه وتلك المنتجه بنظم إستزراع فى أعداد صغيره أو فى مجموعات أن تنمو بنفس الكفاءة.

                           V.      يعتبر نظام الإستزراع وتركيب بيئة الزرع أكثرالعوامل تأثيراّ على التطور الجينينى ومستوى التعبير الجينى لأجنة الأبقار المنتجه معملياّ .

                         VI.      تعتبر طريقة التجميد السريع باستخدام الــ Cryotopطريقة فعالة لتجميد أجنة الأبقارالمتحصل عليها معمليا مقارنة بالطريقه التقليدية لتجميد الأجنة (التجميد البطئ).

أخر تحديث للصفحة : 5/26/2015 2:00:35 PM
عدد القراءات : 1835

جميع الحقوق محفوظة لجامعة دمنهور © 2016
تصميم وتنفيذ مشروع البوابة الإلكترونية